一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法与流程

本发明属于胭脂树色素储存技术领域，涉及一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法。

背景技术：

焦胭脂红(annatto)是从热带灌木bixaorellanal.(bixaceae)种子的外层分离的一种类胡萝卜素。其主要着色成分是疏水性的二羧酸单甲基酯类胡萝卜素胭脂树素(bixin)和二羧酸类胡萝卜素降胭脂树素(norbixin)。

胭脂树素可作为食品着色剂，欧盟已认可其食用安全性(e160b)，在食品工业中广泛应用，包括面粉、糖果、乳制品、酱制品、软饮料、冰淇淋和水产品等。美国食品药品监督局(foodanddrugadministration，fda)已对其认证为“公认为安全”(generallyrecognizedassafe，gras)的食品、药品和化妆品添加剂。在我国，胭脂树素作为食品添加剂已广泛应用于饮料、面点、甜品、干(奶)酪外皮、肠衣、烟熏制品、乳制品等。gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂国家标准》规定了胭脂红的最大添加量为0.01～0.6g/kg。

国内企业常使用添加麦芽糊精的方法依据两者间疏水引力、氢键相互作用提高胭脂树素水相稳定性，但是单纯使用麦芽糊精后的胭脂树素存在光稳定性弱、且易被细菌污染等缺陷，因此，为了提高其防腐性能和光稳定性等性能，往往需要额外加入防腐剂等助剂。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了提供一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法，其可有效抑制胭脂树素的光降解，避免了原料的浪费，节约了成本等。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取胭脂树素溶解于香芹酚中，得到胭脂树素的香芹酚溶液；

(2)再将胭脂树素的香芹酚溶液与大豆卵磷脂水溶液、吐温20和水混合，摇匀避光静置过夜，得到澄清透明的胭脂树素微乳液，即实现胭脂树素的稳定水相存在。

进一步的，步骤(1)中，胭脂树素的香芹酚溶液的质量浓度为0.5％。

进一步的，步骤(2)中，胭脂树素的香芹酚溶液、大豆卵磷脂水溶液中大豆卵磷脂的含量、吐温20和水的质量比为5％：5％：45％：45％。

进一步的，步骤(2)中，大豆卵磷脂水溶液的质量分数为10-15％。

进一步的，步骤(2)中，大豆卵磷脂水溶液先与吐温20搅拌混合，得到表面活性剂溶液后(此处的表面活性剂即由大豆卵磷脂和吐温20构成)，再与胭脂树素的香芹酚溶液和水混合。

进一步的，步骤(2)中，摇匀避光静置过夜的温度为环境温度。

进一步的，步骤(2)中，配成的胭脂树素微乳液的质量分数为0.025-0.05％。

进一步的，步骤(2)中，配成的胭脂树素微乳液的质量分数为0.025％。

进一步的，步骤(2)中，配成的胭脂树素微乳液的质量分数为0.05％。

进一步的，步骤(2)中，配成的胭脂树素微乳液的质量分数为0.03％。

天然酚类化合物——香芹酚是一种广谱抗菌植物精油，无毒副作用，被fda批准为gras级食品添加剂。香芹酚化学结构包括能与水分子形成氢键的酚羟基，同时含有疏水的苯环和烷烃基团，因此，本发明推测其具有类似丙二醇(pg)作为表面活性剂助剂的功能，用于辅助稳定水相纳米颗粒界(表)面结构，即：在高分子表面活性剂分子间空隙处，通过疏水力、π-堆积、氢键、静电引力、范德华力等，使小分子表面活性剂助剂与表面活性剂在两相界面聚集，达到降低界面张力的目的。酚类化合物在低剂量用量下，其苦涩味不易被舌头味蕾识别，因此，不会对食品原有风味产生影响。

卵磷脂(lecithin)是一类存在于生物界的含磷脂类物质，卵磷脂不溶于水，溶于乙醚、石油醚、四氯化碳、氯仿，是良好的表面活性，大豆卵磷脂的hlb值约为7。

吐温20(tween-20)，化学名称聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，呈琥珀色，为油状液体。hlb＝16.7。属于水包油型乳化剂。

微乳液的粒径一般小于100nm，分为w/o(油包水)型、o/w(水包油)型、o/w/o型、w/o/w型、和双连续型，也可将其分为winsori、ii、iii和iv四种经典体系。本发明采用的是shah这种制备方法。将表面活性剂、助表面活性剂和油先以一定的比例混合均匀，然后缓慢向其中滴加水相，当体系中水量达到一定含量时形成微乳液，该法通常用于制备油包水和水包油型微乳液。

以香芹酚作为油相用于装载疏水性的胭脂树素，大豆卵磷脂(aq)和吐温20共同构成了hlb值约为15.7的复合型表面活性剂，以自乳化的方式形成微乳液。使得原本疏水的胭脂树素被包裹在亲水的微乳液中。

此外，本发明中，大豆卵磷脂在浓度为12％时达到极限溶解性，浓度大于12％时，卵磷脂的脂肪链无法充分展开。且若复合型表面活性剂(大豆卵磷脂+吐温)中，大豆卵磷脂含量超过12％，无论怎样配比，均无法形成澄清透明的微乳液。若大豆卵磷脂的含量小于8％，形成的微乳液稀释稳定性较差。

如图1所示，当吐温20:卵磷脂质量比为9:1时，有少量配比可以通过自乳化形成澄清透明的微乳液；当吐温20:卵磷脂质量比为9.5:0.5时，有少量配比可以通过自乳化形成澄清透明的微乳液但是这些配比的稀释稳定性较差；当吐温20:卵磷脂质量比为8:2时，无论怎样配比均无法形成澄清透明的微乳液。(注：三相图的空白部分是由于卵磷脂必须先在水中以约12％的浓度溶解过夜使脂肪链充分展开，所以水在三相中的含量有下限。)

如图2所示，当且仅当吐温20:卵磷脂质量比为9:1左右时，图中的阴影部分可以自乳化形成澄清透明微乳液的配比。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)采用自乳化的方式构建微乳液，无需加热或搅拌，大大降低了能耗可达到节能减排的目的；

(2)胭脂树素微乳液显著抑制了胭脂树素的光降解，避免了原料的浪费，节约了成本；

(3)该微乳液在高温下会发生相变，但冷却至室温后，重新形成微乳液，重新形成的微乳液粒径分布与初始条件下的微乳液粒径分布一致；所以储存条件更加灵活便捷；

(4)本发明工艺流程简单，不涉及复杂设备，工作参数易于控制，可全自动化生产，显著提高效率，缩短开发周期；

(5)自乳化过程中不再添加任何化学试剂，不会引入新的污染，同时由于各成分的配置过程简单，不会产生大量废水，可有效减少对环境破坏，属于绿色加工。

附图说明

图1从上至下依次为吐温20:卵磷脂质量比9:1制备微乳液的照片三相图；吐温20:卵磷脂质量比9.5:0.5制备微乳液的照片三相图；吐温20:卵磷脂质量比8:2制备微乳液的照片三相图。

图2为从上至下依次为吐温20:卵磷脂质量比9:1制备微乳液的三相图；吐温20:卵磷脂质量比9.5:0.5制备微乳液的三相图；吐温20:卵磷脂质量比8:2制备微乳液的三相图。

图3为365nm(uva)光照环境下(a)所得产品jo(sample)和等浓度胭脂树素的dmf溶液(blank)和等浓度空白微乳液(control)的照片；(b)胭脂树素在微乳液和dmf中的降解动力学曲线；(c)胭脂树素微乳液和微乳液的粒径和pdi变化。

图4为302nm(uvb)光照环境下(a)所得产品jo(sample)和等浓度胭脂树素的dmf溶液(blank)和等浓度空白微乳液(control)的照片；(b)胭脂树素在微乳液和dmf中的降解动力学曲线；(c)胭脂树素微乳液和微乳液的粒径和pdi变化。

图5为365nm(uva)辐照0-8h所得产品jo(sample)(a)和等浓度胭脂树素的dmf溶液(blank)(b)中胭脂树素同分异构体之间的相互转变。

图6为302nm(uvb)辐照0-8h所得产品jo(sample)(a)和等浓度胭脂树素的dmf溶液(blank)(b)中胭脂树素同分异构体之间的相互转变。

图7为80℃热储8h(a)所得产品jo(sample)和等浓度胭脂树素的dmf溶液(blank)和等浓度空白微乳液(control)的照片；(b)胭脂树素在微乳液和dmf中的降解动力学曲线；(c)胭脂树素微乳液和微乳液的粒径和pdi变化。

图8为80℃孵化0-24h后所得产品jo(sample)(a)和等浓度胭脂树素的dmf溶液(blank)(b)中胭脂树素同分异构体之间的相互转变。

图9为所得产品jr(sample)和等浓度空白微乳液(control)从环境温度(～25℃)加热至80℃保温20min后再冷却至环境温度(～25℃)的照片(a)以及使用流变仪模拟研究粘度随温度的变化(b)和(c)，其中，(b)为所得产品jo(sample)的粘度随温度变化的流变图，(c)为等浓度空白微乳液(control)的粘度随温度变化的流变图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中，大豆卵磷脂(纯度大于90％)购买于上海麦克林生化科技有限公司(上海，中国)，所得大豆卵磷脂溶液通过将大豆卵磷脂分散于水中溶解过夜得到。胭脂树素(红木素，纯度89.24％，产地：秘鲁)购买于hebeiblessjoybio-techco.,ltd(河北佑赞乐生物科技有限公司，石家庄，中国)。

其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。

实施例1：

一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法，其具体过程如下：

将150mg胭脂树素溶解在29.85g香芹酚中，配置成0.5％w/w的胭脂树素油溶液。取25g的0.5％w/w的胭脂树素香芹酚油溶液与208.3g的12％w/w大豆卵磷脂水溶液、225.0g吐温20和41.7g水混合，手动摇匀，环境温度下避光静置贮藏过夜，制备500g澄清透明的胭脂树素微乳液，此时，胭脂树素质量分数为0.025％w/w。取100ml用纯净水稀释至3l即得橙色色素产品jo。

使用不同紫外波长，即：365nm(uva)、302nm(uvb)的紫外灯辐照胭脂树素微乳液(sample，实施例1制备)、胭脂树素dmf(blank)和空白微乳液(control)，设置紫外辐照功率为15w，灯管距离样品的垂直距离为10cm，光照时间为0-8h。上述sample、blank经紫外辐照后测定化学稳定，即：胭脂树素降解动力学系数和半衰期(依据abs460的吸光值)，并进一步研究胭脂树素的异构化；sample和control经紫外辐照后测定其物理稳定性，即：分析其粒径和pdi的变化。(见图3～4)

如图3(a)所示，365nm(uva)辐照可显著降解胭脂树素，光照8h后，胭脂树素dmf溶液颜色显著变浅；将胭脂树素分散至微乳液中可显著抑制其uva光降解，光照8h后胭脂树素颜色未发生明显变化。胭脂树素光降解动力学符合一级动力学方程，即：降解系数(k)随时间变化符合方程(2)，胭脂树素降解的半衰期(t1/2)随降解系数(k)的变化符合方程(3)。

ct＝c0e^-kt(2)

t1/2＝-(ln0.5)k^-1(3)

其中，c0为胭脂树素初始浓度(mg/ml)，ct为不同处理时间后胭脂树素的浓度(mg/ml)。

如图3(b)所示，香芹酚微乳液可显著抑制胭脂树素降解动力学常数，k(sample-uva)可降低至k(blank-uva)的0.24(表2-1)，物理稳定性分析结果表明，365nm辐照前后，胭脂树素微乳液和空白微乳液乳滴大小和pdi未发生显著变化，说明胭脂树素微乳液结构稳定，在365nm辐照8h后，仍保持初始环境下均一的粒径分布。

如图4所示，302nm(uvb)辐照8h仍会显著降解dmf中溶解的胭脂树素，香芹酚微乳则可显著抑制胭脂树素uvb光降解，其降解动力学常数k(sample-uvb)是胭脂树素在dmf溶液中降解系数k(blank-uvb)的0.24(表2-1)。粒径分布研究表明，uvb光照8h未改变胭脂树素微乳液和空白微乳液的粒度和pdi，证明，胭脂树素微乳液具有良好的光照稳定性。

继续对实施例所得样品等进行色谱分析，hplc色谱条件如下：流动相a为1％的乙酸水溶液，流动相b为乙腈，设置线性梯度洗脱程序如下：0min时，乙腈67％v/v；10min时，乙腈33％v/v；15min时，乙腈25％v/v；40min时，乙腈25％v/v。设置流速为1ml/min，柱温25℃，色谱柱为watersatlantist3(250×4.6mm，5μm)分析柱，监测波长为460nm。(见图5～6)

图5和图6中，峰1为同分异构体trans-bixin，峰2为同分异构体9'-13'-di-cis-bixin，峰3为同分异构体9'-cis-bixin。

使用hplc-pad研究胭脂树素在uva、uvb辐照过程中同分异构体之间的动态转化，结果如图5和图6所示。在dmf溶液中，uva、uvb辐照均促使9'-cis-bixin(peak3)和9'-13'-di-cis-bixin(peak2)均向trans-bixin(peak1)同分异构体转化，微乳液虽可显著抑制胭脂树素(bixin)的光氧化降解，但无法阻止9'-cis-bixin和9'-13'-di-cis-bixin向trans-bixin异构体转化。导致上述同分异构体之间转化的主要因素是外加能量差异导致，提供较高转化能的紫外可将9'-cis-bixin直接转化为trans-bixin同分异构体。

参照上述实施例1内容调整大豆卵磷脂水溶液用量，具体结果参见图1和图2所示。如图1所示，当吐温20:卵磷脂质量比为9:1时，有少量配比可以通过自乳化形成澄清透明的微乳液；当吐温20:卵磷脂质量比为9.5:0.5时，有少量配比可以通过自乳化形成澄清透明的微乳液但是这些配比的稀释稳定性较差；当吐温20:卵磷脂质量比为8:2时，无论怎样配比均无法形成澄清透明的微乳液。(注：三相图的空白部分是由于卵磷脂必须先在水中以12％的浓度溶解过夜使脂肪链充分展开，所以水在三相中的含量有下限。)

如图2所示，当且仅当吐温20:卵磷脂质量比为9:1左右时，图中的阴影部分可以自乳化形成澄清透明微乳液的配比。

实施例2：

一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法，其具体过程如下：

将40mg胭脂树素溶解在7.960g香芹酚中，配置成0.5％w/w的胭脂树素油溶液。取2.50g的0.5％w/w的胭脂树素香芹酚油溶液与20.83g的12％w/w大豆卵磷脂水溶液、22.50g吐温20和4.17g水混合，手动摇匀，环境温度下避光静置贮藏过夜，制备50g澄清透明的胭脂树素微乳液，此时，胭脂树素质量分数为0.025％w/w。取10ml用纯净水稀释至1l即得黄色色素产品jy。

在80℃下热储胭脂树素微乳液(sample，实施例2制备)、胭脂树素dmf(blank)和空白微乳液(control)，设置热储时间为0-24h，热储后，将样品冷却至环境温度(～25℃)。上述sample、blank经热储冷却后测定化学稳定，即：胭脂树素降解动力学系数和半衰期(依据abs460的吸光值)，进一步评价胭脂树素异构化机制；sample和control经热储冷却后测定其物理稳定性，即：分析粒径和pdi的变化。(见图7～8)

如图7所示，80℃热储24h后，胭脂树素可在dmf溶液和微乳液中发生热降解，热降解动力学符合一级动力学方程，降解动力学系数k(sample/blank-80℃)介于uvb和uvc光降解胭脂树素k(sample/blank-uvb和sample/blank-uvc)之间。然而，k(sample-80℃)显著大于k(blank-80℃)，胭脂树素在微乳液中的半衰期也低于在dmf中的半衰期(表2-1)。上述结果表明，热储过程中，微乳液未有效抑制胭脂树素的热降解。另一方面，80℃热储8h(冷却至25℃后检测粒径和pdi值)未导致胭脂树素微乳液和空白微乳液粒径发生显著变化，pdi值虽有所改变，但仍显著低于0.2，因此，认为80℃热储8h后冷却至25°c未改变微乳液粒径分布。

继续对实施例所得样品等进行色谱分析，hplc色谱条件如下：流动相a为1％的乙酸水溶液，流动相b为乙腈，设置线性梯度洗脱程序如下：0min时，乙腈67％v/v；10min时，乙腈33％v/v；15min时，乙腈25％v/v；40min时，乙腈25％v/v。设置流速为1ml/min，柱温25℃，色谱柱为watersatlantist3(250×4.6mm，5μm)分析柱，监测波长为460nm。(见图9)

使用hplc-pad研究胭脂树素在80℃热储过程中同分异构体之间的动态转化，结果如图8所示。在80℃热储过程中，9'-cis-bixin主要向trans-bixin异构体转化。导致上述同分异构体之间转化的主要因素是外加能量差异导致，提供较高转化能的紫外可将9'-cis-bixin直接转化为trans-bixin同分异构体(例1)，而相对较低能量的热储(80℃)则有利于9'-cis-bixin转化为9'-13'-di-cis-bixin同分异构体，再进一步转化为9'-cis-bixin同分异构体。

实施例3：

一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法，其具体过程如下：

步骤1)将20mg胭脂树素溶解在3.980g香芹酚中，配置成0.5％w/w的胭脂树素油溶液。取1.00g的0.5％w/w的胭脂树素香芹酚油溶液与8.34g的12％w/w大豆卵磷脂水溶液、9.00g吐温20和1.86g水混合手动摇匀，制备20.00g深红色澄清透明的胭脂树素微乳液jr，此时，胭脂树素质量分数为0.05％w/w。

步骤2)取1.00g香芹酚与8.34g的12％w/w大豆卵磷脂水溶液、9.00g吐温20和1.86g水混合手动摇匀，制备20.00g空白微乳液。

步骤3)使用流变仪拟合shearrate-shearstress粘度模型并模拟研究热储20min过程中胭脂树素微乳液和空白微乳液的相变过程。首先取13ml步骤1)新鲜制备的胭脂树素微乳液加入到concentriccylinder夹具中，设置剪切速率变化为0.1-100/s，恒定温度为25℃，拟合shearrate-shearstress粘度模型。进一步模拟热储环境研究粘度-温度关系，将13ml新鲜制备的胭脂树素微乳液和空白微乳液加入到concentriccylinder夹具中，设置温度程序为：(1)25℃恒温10min；(2)温度以3℃/min升温速率升高至80℃；(3)80℃恒温20min；(4)温度以3℃/min降温速率降低至25℃；(5)25℃恒温10min。设置恒定剪切速率为100/s。再取步骤2)空白微乳液13ml重复相同步骤。研究胭脂树素微乳液和空白微乳液的粘度在恒定剪切速率作用下随温度的变化。(见图9)

如图9(a)所示，80℃热处理20min后，胭脂树素微乳液(sample)和空白微乳液(control)均从透明变为浑浊，冷却至环境温度(～25℃)后，又变为澄清透明。上述结果表明，胭脂树素微乳液和空白微乳液在80℃加热过程中发生相变。进一步使用流变仪模拟研究加热至80℃保温20min以及冷却至25℃过程中粘度随温度的变化，结果如图9(b)和(c)所示，随温度的升高，胭脂树素微乳液和空白微乳液粘度降低，进一步加热至～50℃及以上温度，两种微乳液的粘度均显著增加，说明上述两种微乳液在～50℃发生相变，加热至80℃并保持20min未显著降低流体粘度。上述流变学特征可用于解释两种微乳液加热至80℃变浑浊的现象(图9(a))。胭脂树素微乳液和空白微乳液分别冷却至60℃和70℃时粘度显著降低，说明上述两种微乳液分别在60℃和70℃时发生相转变，进一步降低两种微乳液的温度，其粘度随温度降低而均匀增加，当温度降低至25℃时，其粘度与初始温度下的粘度(加热前的粘度)一致。结合图7(c)热储过程微乳液物理稳定性评价结果，即：两种微乳液加热后冷却，其粒径分布未发生显著变化，可说明，胭脂树素微乳液和空白微乳液经加热至50℃发生相变，冷却至环境温度为25℃后可进一步转变为初始微乳液。

综上所述，一种能使胭脂树素在水相中稳定存在的方法所需的设备简单，可以满足从深红色到浅黄色使用色素产品的实际生产需求；胭脂树素对微乳液本身热稳定性的影响可以忽略不计；产品水溶性、光稳定性、热稳定性均相对单一色素有了极大的提高；自乳化过程不耗能；体高了生产效率，节约了成本；所得的色素产品的品质高、食用安全性好。因此该技术适合应用于大规模工业化生产。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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