一种含有植物乳杆菌JLAU103胞外多糖的乳制品的制备方法与流程

本发明属于功能乳制品制备的技术领域，具体涉及一种含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品的制备方法。

背景技术：

肠道黏膜是动物体内与外界环境之间最大的接触表面，它不仅在营养物质的消化和吸收中发挥着重要作用，而且对大多数外来病原微生物、毒素侵扰具有防御屏障作用。肠道黏膜屏障主要由肠上皮细胞屏障、免疫屏障、生物屏障、化学屏障共同组成。近年来研究表明，肠道屏障功能障碍与多种肠道疾病(腹泻、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、食物过敏)的发病机制密切有关。因此，发掘调节肠道黏膜屏障作用的天然活性物质，将为肠道疾病的治疗和预防提供现实意义。

植物乳杆菌胞外多糖(exopolysaccharides，eps)是植物乳杆菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的黏液多糖或荚膜多糖的总称。其作为一种绿色、安全的天然活性高分子聚合物，已被证实具有多种生理活性，包括抗氧化、降血压、抗肿瘤、改善肠道微生态环境和增强人体免疫力等。目前没有一种乳制品中添加过植物乳杆菌胞外多糖。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种添加有植物乳杆菌胞外多糖的乳制品制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)向灭活后的植物乳杆菌jlau103发酵液加入三氯乙酸水溶液至三氯乙酸终浓质量分数为4-6％，室温下搅拌处理1.5-2.5小时，离心处理后得到上清液；

(2)向上清液中加入其2-3倍体积的无水乙醇，冷藏静置处理10-12小时后，离心处理，得到沉淀；

(3)将沉淀用蒸馏水溶解后，装入分子截流量为8000～14000da的透析袋中透析45-50h，每8h换一次蒸馏水，再经浓缩、冷冻干燥制得粗多糖；

(4)将粗多糖用蒸馏水溶解后，经deae-sepharosefastflow离子交换柱层析，上样量90-110mg，依次用蒸馏水、0.2mol/lnacl、0.5mol/lnacl进行线性梯度洗脱，洗脱速度为0.8-1.2ml/min，每管收集4-6ml，采用苯酚硫酸法逐管检测胞外多糖含量，按胞外多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，再进行去离子水透析，冷冻干燥后得到植物乳杆菌jlau103胞外多糖；

(5)按重量份计，将70-80份全脂牛乳、10-14份白砂糖、7-10份小球藻粉、12-16份鸡蛋粉、0.2-0.6份植物乳杆菌jlau103胞外多糖、0.05-0.09份柠檬酸钠混合后，按照料水比为1:20-25g/ml的比例向其中加入水，搅拌处理后，依次进行均质、灭菌、冷却、接种、恒温发酵、冷却、灌装、后熟冷藏后，制得含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品。

具体地，上述步骤(1)中，植物乳杆菌jlau103发酵液是由植物乳杆菌jlau103按体积分数为3％的接种量接种到液体sdm培养基中，37℃培养24h后制得的。

具体地，上述步骤(1)中，三氯乙酸水溶液初始质量分数为75-85％。

具体地，上述步骤(1)和步骤(2)中，离心处理时，离心力大小均为10000g，离心时温度均为4℃，离心时间均为40-50min。

具体地，上述步骤(2)中，冷藏静置处理时的温度为3-5℃。

具体地，上述步骤(4)中，均质处理时，均质的温度为58-62℃，均质的压力18-20mpa。

具体地，上述步骤(4)中，接种所用的菌种为保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌，接种量为1-3％。

具体地，上述步骤(4)中，恒温发酵的温度为39-41℃，恒温发酵处理的时间为6-7小时。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品，产品的光泽度好，奶香协调，香醇浓郁，并且营养含量高，具有免疫调节的作用；

2、本发明步骤(1)至步骤(4)中提供的制备植物乳杆菌jlau103胞外多糖的方法，产品得率高，得到的产品纯度高；

3、本发明制得的乳制品中含有小球藻和鸡蛋粉发酵后的活性物质，其能与植物乳杆菌jlau103胞外多糖共同作用，能有效的改善免疫抑制小鼠的免疫调节功能。

附图说明

图1为免疫抑制小鼠胸腺指数(a)和脾脏指数(b)，其中含不同字母表示组间差异显著p<0.05。

图2为免疫抑制小鼠小肠组织绒毛长度v与隐窝深度c的比值，其中含不同字母表示组间差异显著p<0.05。

图3为免疫抑制小鼠血清细胞因子il-2(a)和il-6(b)，其中含不同字母表示组间差异显著p<0.05。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)向灭活后的植物乳杆菌jlau103发酵液加入质量分数为75％的三氯乙酸水溶液至三氯乙酸终浓质量分数为4％，室温下搅拌处理1.5小时，离心处理后得到上清液，离心处理时，离心力大小为10000g，离心时温度为4℃，离心时间为40min，其中植物乳杆菌jlau103发酵液是由植物乳杆菌jlau103按体积分数为3％的接种量接种到液体sdm培养基中，37℃培养24h后制得的，

(2)向上清液中加入其2倍体积的无水乙醇，3℃冷藏静置处理10小时后，离心处理，离心力大小为10000g，离心时温度为4℃，离心时间为40min，得到沉淀；

(3)将沉淀用蒸馏水溶解后，装入分子截流量为8000da的透析袋中透析45h，每8h换一次蒸馏水，再经浓缩、冷冻干燥制得粗多糖；

(4)将粗多糖用蒸馏水溶解后，经deae-sepharosefastflow离子交换柱层析，上样量90mg，依次用蒸馏水、0.2mol/lnacl、0.5mol/lnacl进行线性梯度洗脱，洗脱速度为0.8ml/min，每管收集4ml，采用苯酚硫酸法逐管检测胞外多糖含量，按胞外多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，再进行去离子水透析，冷冻干燥后得到植物乳杆菌jlau103胞外多糖；

(5)按重量份计，将70份全脂牛乳、10份白砂糖、7份小球藻粉、12份鸡蛋粉、0.2份植物乳杆菌jlau103胞外多糖、0.05份柠檬酸钠混合后，按照料水比为1:20g/ml的比例向其中加入水，搅拌处理后，依次进行均质、灭菌、冷却、接种、恒温发酵、冷却、灌装、后熟冷藏后，制得含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品，其中均质处理时，均质的温度为58℃，均质的压力18mpa，接种所用的菌种为保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌，接种量为1％，恒温发酵的温度为39℃，恒温发酵处理的时间为6小时。

实施例2

一种含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)向灭活后的植物乳杆菌jlau103发酵液加入质量分数为80％的三氯乙酸水溶液至三氯乙酸终浓质量分数为5％，室温下搅拌处理2.0小时，离心处理后得到上清液，离心处理时，离心力大小为10000g，离心时温度为4℃，离心时间为45min，其中植物乳杆菌jlau103发酵液是由植物乳杆菌jlau103按体积分数为3％的接种量接种到液体sdm培养基中，37℃培养24h后制得的，

(2)向上清液中加入其2.5倍体积的无水乙醇，4℃冷藏静置处理11小时后，离心处理，离心力大小为10000g，离心时温度为4℃，离心时间为45min，得到沉淀；

(3)将沉淀用蒸馏水溶解后，装入分子截流量为10000da的透析袋中透析48h，每8h换一次蒸馏水，再经浓缩、冷冻干燥制得粗多糖；

(4)将粗多糖用蒸馏水溶解后，经deae-sepharosefastflow离子交换柱层析，上样量100mg，依次用蒸馏水、0.2mol/lnacl、0.5mol/lnacl进行线性梯度洗脱，洗脱速度为1.0ml/min，每管收集5ml，采用苯酚硫酸法逐管检测胞外多糖含量，按胞外多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，再进行去离子水透析，冷冻干燥后得到植物乳杆菌jlau103胞外多糖；

(5)按重量份计，将75份全脂牛乳、12份白砂糖、8份小球藻粉、14份鸡蛋粉、0.4份植物乳杆菌jlau103胞外多糖、0.07份柠檬酸钠混合后，按照料水比为1:23g/ml的比例向其中加入水，搅拌处理后，依次进行均质、灭菌、冷却、接种、恒温发酵、冷却、灌装、后熟冷藏后，制得含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品，其中均质处理时，均质的温度为60℃，均质的压力19mpa，接种所用的菌种为保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌，接种量为2％，恒温发酵的温度为40℃，恒温发酵处理的时间为6.5小时。

实施例3

一种含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)向灭活后的植物乳杆菌jlau103发酵液加入质量分数为85％的三氯乙酸水溶液至三氯乙酸终浓质量分数为6％，室温下搅拌处理2.5小时，离心处理后得到上清液，离心处理时，离心力大小为10000g，离心时温度为4℃，离心时间为50min，其中植物乳杆菌jlau103发酵液是由植物乳杆菌jlau103按体积分数为3％的接种量接种到液体sdm培养基中，37℃培养24h后制得的，

(2)向上清液中加入其3倍体积的无水乙醇，5℃冷藏静置处理12小时后，离心处理，离心力大小为10000g，离心时温度为4℃，离心时间为50min，得到沉淀；

(3)将沉淀用蒸馏水溶解后，装入分子截流量为14000da的透析袋中透析50h，每8h换一次蒸馏水，再经浓缩、冷冻干燥制得粗多糖；

(4)将粗多糖用蒸馏水溶解后，经deae-sepharosefastflow离子交换柱层析，上样量110mg，依次用蒸馏水、0.2mol/lnacl、0.5mol/lnacl进行线性梯度洗脱，洗脱速度为1.2ml/min，每管收集6ml，采用苯酚硫酸法逐管检测胞外多糖含量，按胞外多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，再进行去离子水透析，冷冻干燥后得到植物乳杆菌jlau103胞外多糖；

(5)按重量份计，将80份全脂牛乳、14份白砂糖、10份小球藻粉、16份鸡蛋粉、0.6份植物乳杆菌jlau103胞外多糖、0.09份柠檬酸钠混合后，按照料水比为1:25g/ml的比例向其中加入水，搅拌处理后，依次进行均质、灭菌、冷却、接种、恒温发酵、冷却、灌装、后熟冷藏后，制得含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品，其中均质处理时，均质的温度为62℃，均质的压力20mpa，接种所用的菌种为保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌，接种量为3％，恒温发酵的温度为41℃，恒温发酵处理的时间为7小时。

实施例1制得的含有植物乳杆菌jlau103胞外多糖的乳制品对免疫抑制小鼠的免疫调节作用试验：

spf级balb/c小鼠充分适应环境后，用苦味酸标记，将60只小鼠随机分成六组：正常对照组(nc)、模型组(mc)、阳性对照组(pc)、乳制品低剂量组(ld)、乳制品中剂量组(md)和乳制品高剂量组(hd)。实验采取连续3天腹腔注射的方式建造免疫抑制模型，连续10天灌胃治疗的模式。造模期间：正常对照组注射无菌生理盐水，其余小鼠每天注射相应体积浓度为80mg/kg的环磷酰胺。灌胃期间：阳性对照组每天灌胃浓度为40mg/kg的盐酸左旋咪唑水溶液，高、中、低剂量组分别灌胃200、100、50mg/(kg×d)乳制品，正常对照组、模型组则灌胃相应体积的生理盐水。灌胃结束，所有试验动物进食不进水处死。

免疫器官指数测定

灌胃周期结束24h后，实验小鼠称重处死，分离出完整的胸腺、脾脏，在生理盐水中清洗，滤纸吸取残存的生理盐水，称取胸腺、脾脏重量(mg)和小鼠体重(g)的比率代表胸腺、脾脏指数。公式如下：

组织形态学观察

小鼠处死后迅速剖腹取出小肠组织，放入10％多聚甲醛固定48h，常规石蜡包埋，切片，he染色，光学显微镜下观察组织形态，运用图像数据分析系统系统准确测量肠绒毛长度及隐窝深度，取其平均值，并计算其比值。

血清中细胞因子的测定

采用眼球取血的方式获得血液，室温静置2h,3000×g,4℃，离心10min，取上册血清，利用elisa试剂盒，按照试剂盒说明书要求测定血清中il-2和il-6的浓度。

数据分析

采用anova比较各组间的数据，采用tukey'多重比较检验和dunnett多重比较检验。显著结果的统计学意义设为p<0.05。所有数据均表示为平均值±标准偏差(n≧3)。

结果与分析

实施例1制得的乳制品对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

如图1a和1b所示，与空白对照组(nc)相比，模型组小鼠(mc)的胸腺指数和脾脏指数均出现显著下降(p<0.05)，说明环磷酰胺造成了小鼠的免疫抑制。与模型对照组相比，低、中、高剂量乳制品处理组均能显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数(p<0.05)，且呈现出较高的浓度依赖关系。同时，中、高剂量乳制品处理组能显著提高免疫抑制小鼠的脾脏指数(p<0.05)。

乳制品对免疫抑制小鼠小肠损伤的保护作用

保持小肠的完整性和功能性是发挥正常屏障功能的前提，小肠受到损伤时，肠腔绒毛表面积减少，肠道通透性增加，隐窝不断分化产生新的上皮细胞更新损伤。如图2所示，与空白对照组相比，模型组小鼠肠腔绒毛长度(v)与隐窝深度(c)的比值显著降低(p<0.05)。与模型对照组相比，乳制品处理组小鼠小肠绒毛长度(v)与隐窝深度(c)的比值显著升高(p<0.05)。表明植物乳杆菌jlau103胞外多糖对免疫抑制小鼠小肠的损伤起到一定的保护作用，有助于恢复免疫抑制小鼠小肠上皮细胞的完整性。

乳制品对免疫抑制小鼠血清细胞因子的影响

如图3a和3b所示，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中il-2和il-6的水平均显著降低(p<0.05)。与模型对照组相比，低、中、高剂量乳制品处理组均能不同程度地提高免疫抑制小鼠血清中il-2的水平，其中高剂量乳制品处理组的提升效果显著(p<0.05)；同时，低、中、高剂量乳制品处理组均能显著提高免疫抑制小鼠血清中il-6的水平。

上述试验利用环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型，研究实施例1制得的乳制品对免疫抑制小鼠有免疫调节作用。结果表明，实施例1制得的乳制品能提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数，提高小鼠空肠中绒毛长度与隐窝深度的比值，增加小鼠血清中细胞因子il-6和il-2的分泌。综上，实施例1制得的乳制品具有改善免疫抑制的作用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

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