一种含共轭脂肪酸的发酵乳及其制备方法与流程

本发明涉及一种含共轭脂肪酸的发酵乳及其制备方法，属于发酵技术领域。

背景技术：

共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacid，cla)是亚油酸(linoleicacid，la)在多个碳位上含有共轭双键的一系列十八碳二烯酸的总称。研究表明，cla可作为主要功能因子添加在抗疲劳食品、减肥食品和降胆固醇食品中。

共轭亚麻酸(conjugatedlinolenicacid，clna)是一类由亚麻酸(linolenicacid，lna)衍生得到的共轭二烯或共轭三烯型双键的十八碳三烯脂肪酸，被广泛认为具有抗癌、抗炎症、抗氧化、抗心血管疾病等多种生理功能。

瘤胃动物的乳肉制品是人们日常生活中提取共轭脂肪酸的主要来源。然而，这些食物中的cla和clna含量有限，并不足以满足日常需求。因此，选择合理的方式强化食品中的共轭脂肪酸含量很有必要。

目前，增加人体共轭脂肪酸摄入量的方法主要有两种，一是通过改变饲料配方和饲养方法，提高畜产品中的共轭脂肪酸的含量，但是，这种方法存在技术含量比较高，生产过程比较复杂的缺陷；二是在直接在乳制品中添加共轭脂肪酸进行营养强化，但是，经过巴氏杀菌和均质后乳制品中强化的共轭亚油酸和共轭亚麻酸含量会明显减少，且冷冻保存三周后乳制品中异构体含量会显著下降，感官上也会有轻微的“青草和蔬菜油”味。

因此，急需找到一种制备富含共轭脂肪酸且风味佳的发酵乳的方法。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种富含共轭脂肪酸且风味佳的发酵乳。

[技术方案]

为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种制备含共轭脂肪酸的发酵乳的方法，所述方法为将植物种子加水磨浆，得到浆液；将脂肪酶添加至浆液中进行酶解，得到酶解液；将可生产共轭脂肪酸的菌株接种至酶解液中进行发酵，得到含共轭脂肪酸的发酵乳。

在本发明的一种实施方式中，所述可生产共轭脂肪酸的菌株为短双歧杆菌cgmccno.11828、短双歧杆菌gdmccno.60934、植物乳杆菌cgmccno.8243、鼠李糖乳杆菌gdmccno.60540、干酪乳杆菌gdmccno.60745或发酵乳杆菌gdmccno.60955中的一种或一种以上。

在本发明的一种实施方式中，所述可生产共轭脂肪酸的菌株为短双歧杆菌cgmccno.11828。

在本发明的一种实施方式中，所述植物种子为核桃、巴旦木、大豆、花生、燕麦、椰子或杏仁中的一种或一种以上。

在本发明的一种实施方式中，所述植物种子与水的料水比为1～5:20～30。

在本发明的一种实施方式中，所述植物种子与水的料水比为1:5。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶在浆液中的添加量为20～200u/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶在浆液中的添加量为60u/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解的温度为35～45℃、时间为1～3h。

在本发明的一种实施方式中，所述酶解的温度为37℃、时间为3h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37～42℃、时间为16～24h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37℃、时间为24h。

本发明还提供了上述方法在制备含共轭脂肪酸的发酵乳中的应用。

本发明还提供了一种含共轭脂肪酸的发酵乳，所述发酵乳是使用上述方法制备得到的。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种制备发酵乳的方法，使用此方法，仅需将可生产共轭脂肪酸的菌株接种至经磨浆、酶解处理的植物种子中进行发酵，即可获得含共轭脂肪酸的发酵乳，步骤简单，并且，使用此方法发酵获得的发酵乳中，共轭亚油酸的含量高达3.28mg/ml、共轭亚麻酸的含量高达2.15mg/ml，共轭脂肪酸含量很高。

(2)本发明提供了一种制备发酵乳的方法，使用此方法发酵获得的发酵乳颜色和质地较为均匀，组织细腻，发酵风味细腻浓郁，伴有原料特有的香味，综合感官评分较高。

生物材料保藏

lactobacillusfermentum，于2020年1月10日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号是gdmccno:60955，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

具体实施方式

下述实施例中涉及的核桃、巴旦木和大豆购自江苏无锡欧尚超市；下述实施例中涉及的短双歧杆菌cgmccno.11828记载于公开号为cn105925514a的专利申请文本中；下述实施例中涉及的短双歧杆菌gdmccno.60934记载于公开号为cn110878273a的专利申请文本中；下述实施例中涉及的植物乳杆菌cgmccno.8243记载于公开号为cn103966131a的专利申请文本中；下述实施例中涉及的鼠李糖乳杆菌gdmccno.60540记载于公开号为cn109666615a的专利申请文本中；下述实施例中涉及的干酪乳杆菌gdmccno.60745记载于“第15届益生菌与健康国际研讨会会议指南”中；下述实施例中涉及的脂肪酶购自阿拉丁公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

mrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2hpo4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso4·h2o0.05g/l、吐温801ml/l、琼脂20g/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。

mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2hpo4·3h2o2.6g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、mnso4·h2o0.05g/l、吐温801ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

ph的检测：

取5ml发酵乳，用ph计测定发酵乳的ph。

乳酸菌活菌数的检测：

取1ml发酵乳进行梯度稀释，具体计数方法参照国标gb4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。

总脂肪酸及游离脂肪酸含量的检测：

脂肪酸提取：取200μl样品加入4ml氯仿甲醇混合液(2:1，v/v)，以及100μl的十五烷酸甲酯内标物，充分混合均匀后3500r/min离心5min，下层氯仿层与0.86％的nacl溶液混合并静置分层；搜集有机层过滤，氮吹除去有机溶剂，将提脂瓶保存与-20℃冰箱中；

游离脂肪酸甲酯化：将氮吹干后的样品重悬于400μl甲醇，添加适量重氮甲烷进行直接甲酯化，待黄色维持15min后氮气吹干，重悬于1ml正己烷，转移至样品瓶，过0.22μm有机滤膜后进行气相色谱分析；

总脂肪酸甲酯化：将氮吹后的样品加入0.5mol/l的氢氧化钠－甲醇溶液1ml，置于65℃的水浴锅中恒温保持30min；再加入14％(v/v)的三氟化硼-甲醇溶液1ml，置于70℃水浴中保持5min，取出后自然冷却；加入2ml正己烷，震荡，最后加入4ml饱和氯化钠溶液，用漩涡中震荡仪混匀后，将所有溶液转移至离心管，2000r/min离心5min，取上层有机相，转移至样品瓶，过0.22μm有机滤膜后进行气相色谱分析；

其中，脂肪酸甲酯采用气质联用色谱仪进行检测；岛津气相色谱仪(gc2010plus)，气相柱rtx-wax(30m×0.25mm×0.25μm)，质谱仪(岛津ultraqp2010)；程序升温条件：初始150℃，以5℃/min的速率升温至200℃，保持10min，后以4℃/min升温至240℃，保持10min；采用分流进样，进样量为1μl，分流比为10:1(v/v)，氦气作为载气；进样器温度和检测器温度均为240℃；离子源220℃，强度为70ev。

由gc-ms测得的谱图在nist11标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用面积归一化法定量，得到样品中的总脂肪酸及游离脂肪酸含量。

发酵乳的感官评定：

将发酵成品编号后分装到一次性杯子中，请感官评定员对产品的外观组织、形态、风味、口味、香气等进行评价计分，最后得分为各感官评定员平分的算术平均值。

下述实施例中涉及的乳酸菌菌液的制备方法如下：

取乳酸菌菌液涂布于mrs固体培养基上，37℃厌氧培养24～48h，得到单菌落；挑取单菌落接入mrs液体培养基中，37℃厌氧培养18h，得到一级种子液；将一级种子液按照2％(v/v)的接种量接种至mrs液体培养基中，37℃厌氧培养18h，得到二级种子液；将二级种子液按照2％(v/v)的接种量接种至mrs液体培养基中，37℃厌氧培养18h，得到培养液；将培养液离心取沉淀；将沉淀用生理盐水洗涤后重悬至浓度为1×10⁷cfu/ml，得到菌液。

实施例1-1：发酵乳的制备(核桃+短双歧杆菌cgmccno.11828)

具体步骤如下：

将核桃破壳，取核桃仁；在核桃仁中加入浓度为40g/l的碳酸钠溶液和浓度为100g/l的氢氧化钙溶液至没过核桃仁，得到混合物；将混合物煮沸后，取出混合物中的核桃仁冷水冲洗去皮，得到经处理的核桃仁；按照料水比1:5将经处理的核桃仁与水混合后磨浆，得到浆液；将浆液用均质机在60℃、20mpa下均质后用150目筛子过滤，得到发酵基料；在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200u/ml的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，得到酶解液1-1～1-8；将短双歧杆菌cgmccno.11828菌液按照2％(v/v)的接种量用漩涡振荡器分别添加至酶解液1-1～1-8中，37℃发酵20h，得到发酵乳1-1～1-8。

测定发酵乳1-1～1-8的ph，以及，发酵乳1-1～1-8中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表1～2。

由表1～2可知，添加了20～200u/ml的脂肪酶后，发酵乳中乳酸菌的活菌数有一定程度的下降；当脂肪酸添加量为60u/ml时，发酵乳中la和lna的含量高达22.40mg/ml左右，转化生成的cla和clna的含量高达5.43mg/ml左右，转化率高达20％左右。

将白砂糖按照8％(m/m)的添加量添加至发酵乳1-4中，得到发酵乳成品。

对发酵乳成品进行感官评定，评定结果为：发酵乳颜色和质地较为均匀，组织细腻，发酵风味细腻浓郁，伴有原料特有的香味，综合感官评分较高。

表1发酵乳1-1～1-8的ph和发酵乳1-1～1-8中乳酸菌的活菌数

表2发酵乳1-1～1-8中游离脂肪酸的含量

实施例1-2：发酵乳的制备(核桃+短双歧杆菌cgmccno.11828)

具体步骤如下：

在实施例1-1的基础上，将料水比1:5分别替换为1:10、1:15、1:20，得到发酵乳1-9～1-11。

测定发酵乳1-9～1-11的ph，以及，发酵乳1-9～1-11中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表3～4。

由表3～4可知，在不同料液比下，发酵乳的ph均有所下降(由最初的7左右下降到4.3左右)；但当料液比为1:10、1:15、1:20时，发酵乳中乳酸菌的活菌数远低于当料液比为1:5时。

表3发酵乳1-9～1-11的ph和发酵乳1-9～1-11中乳酸菌的活菌数

表4发酵乳1-9～1-11中游离脂肪酸的含量

实施例1-3：发酵乳的制备(核桃+不同乳酸菌)

具体步骤如下：

在实施例1-1的基础上，将短双歧杆菌cgmccno.11828分别替换为同样可生产共轭脂肪酸的菌株短双歧杆菌gdmccno.60934、发酵乳杆菌gdmccno.60955、植物乳杆菌cgmccno.8243、鼠李糖乳杆菌gdmccno.60540、干酪乳杆菌gdmccno.60745，得到发酵乳1-12～1-16。

测定发酵乳1-12～1-16的ph，以及，发酵乳1-12～1-16中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表5～6。

由表5～6可知，这几株乳酸菌在发酵核桃乳中生长情况良好，但通过检测相应的脂肪酸组成发现并不能转化共轭脂肪酸。

表5发酵乳1-12～1-16的ph和发酵乳1-12～1-16中乳酸菌的活菌数

表6发酵乳1-12～1-16中游离脂肪酸的含量

实施例2-1：发酵乳的制备(巴旦木+短双歧杆菌cgmccno.11828)

具体步骤如下：

按照料水比1:5将巴旦木与水混合后磨浆，得到浆液；将浆液用均质机在60℃、20mpa下均质后用150目筛子过滤，得到发酵基料；在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200u/ml的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，得到酶解液2-1～2-8；将短双歧杆菌cgmccno.11828菌液按照2％(v/v)的接种量用漩涡振荡器分别添加至酶解液2-1～2-8中，37℃发酵20h，得到发酵乳2-1～2-8。

测定发酵乳2-1～2-8的ph，以及，发酵乳2-1～2-8中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表7～8。

由表7～8可知，添加了20～200u/ml的脂肪酶后，发酵乳中乳酸菌的活菌数有一定程度的下降；当脂肪酸添加量为60u/ml时，发酵乳中la和lna的含量高达7.168mg/ml左右，转化生成的cla和clna的含量高达1.338mg/ml左右，转化率高达16％左右。

将白砂糖按照8％(m/m)的添加量添加至发酵乳2-4中，得到发酵乳成品。

对发酵乳成品进行感官评定，评定结果为：发酵乳颜色和质地较为均匀，组织细腻，发酵风味细腻浓郁，伴有原料特有的香味，综合感官评分较高。

表7发酵乳2-1～2-8的ph和发酵乳2-1～2-8中乳酸菌的活菌数

表8发酵乳2-1～2-8中游离脂肪酸的含量

实施例2-2：发酵乳的制备(巴旦木+短双歧杆菌cgmccno.11828)

具体步骤如下：

在实施例2-1的基础上，将料水比1:5分别替换为1:10、1:15、1:20，得到发酵乳2-9～2-11。

测定发酵乳2-9～2-11的ph，以及，发酵乳2-9～2-11中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表9～10。

由表9～10可知，在不同料液比下，发酵乳的ph均有所下降(由最初的7左右下降到4.4左右)；但当料液比为1:10、1:15、1:20时，发酵乳中乳酸菌的活菌数远低于当料液比为1:5时。

表9发酵乳2-9～2-11的ph和发酵乳2-9～2-11中乳酸菌的活菌数

表10发酵乳2-9～2-11中游离脂肪酸的含量

实施例2-3：发酵乳的制备(巴旦木+不同乳酸菌)

具体步骤如下：

在实施例2-1的基础上，将短双歧杆菌cgmccno.11828分别替换为同样可生产共轭脂肪酸的菌株短双歧杆菌gdmccno.60934、发酵乳杆菌gdmccno.60955、植物乳杆菌cgmccno.8243、鼠李糖乳杆菌gdmccno.60540、干酪乳杆菌gdmccno.60745，得到发酵乳2-12～2-16。

测定发酵乳2-12～2-16的ph，以及，发酵乳2-12～2-16中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表11～12。

由表11～12可知，这几株乳酸菌在发酵巴旦木乳中均能较好地生长，但通过检测相应的脂肪酸组成发现，发酵乳中并没有共轭脂肪酸的转化。

表11发酵乳2-12～2-16的ph和发酵乳2-12～2-16中乳酸菌的活菌数

表12发酵乳2-12～2-16中游离脂肪酸的含量

实施例3-1：发酵乳的制备(大豆+短双歧杆菌cgmccno.11828)

具体步骤如下：

将大豆用水浸泡后冲洗去皮，得到去皮后的大豆；按照料水比1:5将去皮后的大豆与水混合后磨浆，得到浆液；将浆液用均质机在60℃、20mpa下均质后用150目筛子过滤，得到发酵基料；在发酵基料中分别添加0、20、40、60、80、100、150、200u/ml的脂肪酶，37℃酶解3h后巴氏灭菌，得到酶解液3-1～3-8；将短双歧杆菌cgmccno.11828菌液按照2％(v/v)的接种量用漩涡振荡器分别添加至酶解液3-1～3-8中，37℃发酵20h，得到发酵乳3-1～3-8。

测定发酵乳3-1～3-8的ph，以及，发酵乳3-1～3-8中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表13～14。

由表13～14可知，添加了20～200u/ml的脂肪酶后，发酵乳中乳酸菌的活菌数有一定程度的下降；当脂肪酸添加量为60u/ml时，发酵乳中la和lna的含量高达5.65mg/ml左右，转化生成的cla和clna的含量高达1.18mg/ml左右，转化率高达17％左右。

将白砂糖按照8％(m/m)的添加量添加至发酵乳3-4中，得到发酵乳成品。

对发酵乳成品进行感官评定，评定结果为：发酵乳颜色和质地较为均匀，组织细腻，发酵风味细腻浓郁，伴有原料特有的香味，综合感官评分较高。

表13发酵乳3-1～3-8的ph和发酵乳3-1～3-8中乳酸菌的活菌数

表14发酵乳3-1～3-8中游离脂肪酸的含量

实施例3-2：发酵乳的制备(大豆+短双歧杆菌cgmccno.11828)

具体步骤如下：

在实施例3-1的基础上，将料水比1:5分别替换为1:10、1:15、1:20，得到发酵乳3-9～3-11。

测定发酵乳3-9～3-11的ph，以及，发酵乳3-9～3-11中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表15～16。

由表15～16可知，在不同料液比下，发酵乳的ph均有所下降(由最初的7左右下降到4.4左右)；但当料液比为1:10、1:15、1:20时，发酵乳中乳酸菌的活菌数远低于当料液比为1:5时。

表15发酵乳3-9～3-11的ph和发酵乳3-9～3-11中乳酸菌的活菌数

表16发酵乳2-9～2-11中游离脂肪酸的含量

实施例3-3：发酵乳的制备(大豆+不同乳酸菌)

具体步骤如下：

在实施例3-1的基础上，将短双歧杆菌cgmccno.11828分别替换为同样可生产共轭脂肪酸的菌株短双歧杆菌gdmccno.60934、发酵乳杆菌gdmccno.60955、植物乳杆菌cgmccno.8243、鼠李糖乳杆菌gdmccno.60540、干酪乳杆菌gdmccno.60745，得到发酵乳3-12～3-16。

测定发酵乳3-12～3-16的ph，以及，发酵乳3-12～3-16中乳酸菌的活菌数和游离脂肪酸的含量，检测结果见表17～18。

由表17～18可知，在发酵豆乳中，这几株乳酸菌均生长较好，但通过检测相应的脂肪酸组成发现其并不能转化共轭脂肪酸。

表17发酵乳3-12～3-16的ph和发酵乳3-12～3-16中乳酸菌的活菌数

表18发酵乳3-12～3-16中游离脂肪酸的含量

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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